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          细胞支原体污染的荧光检测方法点击次数:433 发布时间:2016-09-14

          DNA萤光染色法

          · 原理︰利用萤光染剂(bisbenzimide, Hoechst 33258)侦测支原体污染。此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域,因为支原体之DNA中A-T含量占多数(55~80%),所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后,在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点,即为支原体之DNA,证明有支原体之污染。 

          · 特点︰简单、经济与灵敏,广泛使用,可作为例行之侦测步骤。可以侦测不易培养之支原体,例如M. hyorhinis,较直接培养法快,约一星期即可知道结果。 
          · 缺点:有时仍会有萤光背景,影响判读。 


          步骤: 
          · 取出培养之Vero细胞,吸除培养液。于每个well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液,静置10 min后,吸除固定液,用PBS洗涤三次。 
          · 于每个well中,加入1 ml Hoechst 33258 working solution,室温下静置5-10 min。 
          · 吸掉Hoechst 33258染液后,以无菌水洗涤3次,风干后加入1滴的封片剂,并以盖玻片覆盖之。 
          · 以100x-400x萤光显微镜观察。观察细胞核外是否有蓝色萤光小点或是丝状点之萤光物产生。 
          结果判读︰
          若有支原体污染,在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点或是丝状点。其形状一致,与细胞残片染成之不规则点状物不同。其萤光可维持数星期。
          negative result : 萤光显微镜下,只观察到Vero细胞的细胞核,测试样品没有支原体的污染。(为positive result : 在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点和丝状点,表示测试样品有支原体的污染。 

          Negative result 
          萤光显微镜下,只观察到Vero细胞的细胞核,测试样品没有支原体的污染。 

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