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        企业新闻

        大鼠场景恐惧实验方法点击次数:2120 发布时间:2011-07-04

         www.cxtp.tw     

               场景恐惧(cued and contextual fear conditioning)是基于巴普洛夫条件反射而建立的。它测定动物学习、记忆不悦经历(aversive experience)和环境暗示之间关联的能力。常用声音或光暗示作为条件刺激(conditioning stimulus,CS),以厌恶性刺激(如足电击)作为非条件刺激(unconditioned stimulus,US),二者配对出现。经过这种CS-US训练,动物不仅学会声音和电击之间存在,而且知道电击和周围环境之间也存在某种(context)。前者为听觉暗示条件恐惧(auditory cue fear conditioning)或暗示条件恐惧(cued fear conditioning),后者为关联条件恐惧(contextual fear conditioning)。恐惧是非灵长类动物少有的几种情感反应之一。动物经历条件恐惧后,当再次接触条件刺激时,会产生一系列的生理反应,包括自主神经紧张、应激激素分泌增加以及防御行为增多,等等。凝滞(freezing)即是动物防御行为的一种,是指动物除呼吸之外没有任何其他活动,犹如在黑夜处于迎面而来的汽车强灯照射之下的惊鹿,一动不动。它被认为是评价啮齿类动物恐惧的可靠指标。

        参与条件关联学习过程的脑部结构主要为杏仁核和海马。前者调节恐惧,后者调节与恐惧性事物相关联的学习认知。所以,这一模型主要用于杏仁核和海马依赖的记忆。动物不需要禁水或禁食,且实验设备较为简单,训练时间相对较短。因此,该模型广泛用于转基因小鼠敲除小鼠的行为表型研究。
        • 一、实验设备
        包括条件恐惧箱、隔音箱和关联条件箱,由上海欣软信息科技有限公司研发制作。条件恐惧箱包括与箱底格栅地板相联的电击发生器(可产生0.1~1.0mA的各种强度的电击)、声音发生器(可产生宽频的卡嗒声或低频音),并与计算机相联。隔音箱装有一灯、一小风扇(用于通风和产生背景音)以及一个与声音发生器相联的扩音器。隔音箱门上有一猫眼,用于观察操作箱内的动物。一个隔音箱内可放置两个操作箱,这样可同时观测两只动物,但两动物彼此不能互相看见。关联箱由透明有机玻璃制成,有可移动的格栅式地板和纱窗式顶部。为防止动物滑至格栅下面,格栅条之间距离应足够短。对小鼠和年幼大鼠,关联条件箱通常为26cm*21cm*10cm;格栅地板由不锈钢条(直径1.5mm,中央间距小鼠为0.5cm、年幼大鼠为1.2cm)组成。对成年大鼠,关联箱通常为29cm*23.5cm*19.5cm,格栅地板包括16根不锈钢条(直径2.5cm、中央间距为1.25cm)。此外,还有电压计和声强计,用来检测刺激强度。
        • 二、实验方法
        分为训练和测试两阶段
        (一)训练阶段(*天)
         
        1.调试仪器,以确保格栅地板有电流刺激,扩音器有声音刺激,并分别记录电流强度和声音强度(分贝)。
        2.将大鼠放入条件恐惧箱2min(A相),记录这zui初2min内动物的凝滞(freezing)时间作基线。
        3.接着加入卡嗒声,80Db,30s(B相)。
        4.紧接着再给予电击,0.35mA,2s(C相),完成一轮训练。如需要多轮训练,则重复A、B、C三相训练即可。
        5.记录整个训练阶段动物凝滞时间(s),用以测量动物的非条件恐惧(unconditioned fear)。
        6.将大鼠移开操作箱。用70%的酒精或4%醋酸溶液彻底清洁操作箱,以备进行下一批动物的训练。
        (二)测试阶段 在训练后的第二天进行,包括关联(context)测试、变更关联(altered context)或条件刺激前(pre-conditioning-stimulus,pre-CS)测试以及条件刺激(conditioning stimulus,CS)测试。测试阶段没有电击刺激。关联测试和变更关联测试中也没有听觉条件刺激,但每只动物所用的操作箱应与训练阶段的相同。
        1.关联测试 将动物放入箱内,计算机自动记录动物的凝滞行为。若用人工观察,则观察者(应不知道动物的处理或基因型)用静声秒表通过箱门上的猫眼(小窗口)观察动物的行为并计分:凝滞为1分,活动(moving)为0分(也有只记录凝滞时间)。每10秒观察一次,共5min,这样可记录到30次(bout)可能的凝滞(即zui大凝滞得分为30分)。用在这一阶段记录到的、动物在同一操作箱内的凝滞时间测量动物的关联条件恐惧(contextually conditioned fear)。此为关联测试。观察结束后将动物放回笼内,清洁操作箱,进行下一只动物的观察。
        2.变更关联测试和听觉条件刺激测试 关联测试1h后进行。操作如下:
        (1)将计算机调至所需程序。
        (2)操作箱进行如下改造:1用平滑塑料板取代关联条件箱内的格栅地板;2在箱的对角线加一块有色塑料板,这样将长方体的操作箱变成三角体;3改变嗅觉暗示(olfactory cues)。例如,可在箱的一角放一个装有一滴桔子汁或柠檬汁的杯子,或直接将一滴果汁涂于墙上。然后开始变更关联和听觉条件刺激实验。
        (3)将动物放入经改造后的关联箱(从关联实验中的*只动物开始)。
        (4)启动预置的实验程序,每隔10秒记录动物的凝滞和非凝滞得分(分别为1和0分),共记录3min,即18次可能的凝滞记录(凝滞得分为18)。
        (5)加入听觉条件刺激30秒。重复上述记录3分钟。
        (6)将动物放回笼子,清洁操作箱,进行下一只动物的测试。
        • 三、结果计算与分析
        因为不同类型的学习凝滞时间不同,所以zui常使用百分计:
        关联=(关联测试中的凝滞得分/30)*100%
        变更关联(条件刺激前)=(变更关联中的凝滞得分/18)*100%
        听觉暗示(条件刺激)=(听觉条件刺激中凝滞得分/18)*100%
        对每一不同的凝滞测试计分进行重复测量单因素方差分析(ANOVA),从此比较关联和变更关联或听觉暗示之间的条件恐惧程度,并确定组间差异。一般而言,动物在听觉暗示中的凝滞行为要比关联测试的多。在变更关联测试中,由于关联条件箱已被改造得“面目全非”,训练时动物获得的对周围环境的关联几乎不存在,因此,凝滞行为应该zui少。关联与变更关联差别很大,凝滞计分差别越大。
        如果动物在第二天的关联测试和听觉暗示测试中出现凝滞,而在变更关联测试中不表现凝滞行为,则可认定:动物的感觉和运动功能均正常;能记住前一天与厌恶刺激配对出现的暗示信号;能分辨前一天不与厌恶刺激配对出现的暗示信号,说明动物具有正常的记忆。这些测试中的任何一项增强或减弱,提示调节记忆情感部分的神经解剖、神经递质和基因可能发生变化。
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